宏基因组

宏基因组也称微生物环境基因组。即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因。宏基因组 de novo 测序利用测序技术对环境样品中全部微生物的基因组进行测定，经过序列组装和基因注释，用以解读微生物群体的基因组成及功能，解析微生物群体的多样性和丰度，探索微生物与环境或宿主之间的关系，挖掘新的具有特定功能的基因等。

宏基因组 de novo 测序流程图

　　分析内容

　　1. 原始数据除杂及质量评估

　　2. 物种的组成和丰都

　　3. 稀释曲线

　　4. 不同样品物种组成分析

　　5. 不同样品 COG 功能分布比较分析

　　6. 富集分析

　　7. KEEG pathway 的组成分析

　　8. 根据客户需求进行个性化分析

　　样品信息

　　1. 样品类型：DNA；

　　2. 样品浓度：≥ 20 ng/μL，样品质量要求 OD 260/280 应在 1.8 到 2.0 之间；

　　3. 电泳检测无明显 RNA 条带，基因组条带清晰、完整；

　　4. 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输。

地域性和个体差异性塑造了人类皮肤宏基因组学的功能

　　目标 (Goal)

　　研究皮肤微生物的生理地理特征。

　　背景 (Background)

　　人类皮肤表面由许多环境微生物组成，这些微生物环境有不同的pH 值、温度、湿度、油脂含量和皮肤形态。而这些位置特意的生理特性会影响居住在上面的细菌，真菌以及病毒。反过来，微生物的感知和信号机理，代谢途径，以及免疫特性也可能促进位置特异性。此外，不同个体之间微生物群落组成和功能上也有很大差异。所以作者们通过整合大量存在个体差异的不同皮肤位置上的宏基因组，研究复杂的皮肤微生物的生物地理特性。

　　结果 (Results)

　　该研究选择了15 个健康的成人 (9 个男性，6 个女性) 和 18 个身体位点进行采样，总共采了 263 个样本。对宏基因组测序得到的 reads 分别进行基于 Reference 的微生物群落成分和功能分类;基于 Reference 的菌株分析;不依靠 Reference 的自适应的迭代策略进行 de novo 的组装，构建了新的皮肤基因的目录。研究发现人体皮肤上是由丰富的细菌和非细菌的，其中非细菌主要是真菌和病毒，而且真菌病毒具有明显的位置特异性。比如真菌在外耳道，眉间，耳后沟比较富集，但在脚后跟，脚趾尖处则丰度较低。病毒则在鼻孔和鼻翼沟比较多。其次，不同位置上都是细菌占主导地位，细菌和病毒的含量基本上比较低。此外，作者将皮肤上的微生物与身体其他部位微生物的丰度进行了比较。此外，还发现真菌很少出现在非皮肤的位置上。微生物的耐抗生素性越来越受到关注，所以作者还研究了皮肤微生物中的耐抗生素基因。就耐抗生素的基因而言，同时具有位置和个体特异性。

　　意义 (Significance)

　　该研究提出了一个系统的，多位置的人体皮肤宏基因组学研究方法，其中 Reference-free 方法具有更为广阔的应用前景。文章从医学角度得出的许多结论，具有重要的治疗意义。

　　原文: Oh, J. et al. Biogeography and individuality shape function in the human skin metagenome. Nature, 514:59-64(2014).

永冻层溶解过程中土壤微生物的多组学研究

　　目标 (Goal)

　　揭示微生物在完整的永冻层中的活动。

　　背景 (Background)

　　永冻层指的是持续三年或三年以上的冻结不融的土层。地球的陆地表面超过20% 的面积是被永冻层覆盖，而这部分永冻层储存着大量的碳元素，一旦溶解，可能会引起碳元素由生物圈释放到大气层中。永冻层的这个溶解过程很大程度上会依赖于微生物的活动。可是我们对微生物在完整的永冻层中的活动尚不清楚。这篇文章是将16S，宏基因组学，宏转录组学，宏蛋白质组学结合起来，研究三种土壤状态中的微生物群落的组成和功能。这里的多组学分别是：对16S进行测序是为了确定微生物群落的组成;宏基因组测序是为了确定系统发育和功能基因;宏转录组学测序是为了确定哪些基因表达了;基于质谱检测的宏蛋白质组学则是为了确定产生了哪些蛋白质。

　　结果 (Results)

　　首先，在门的水平上，对三种组学在三种土壤中得到的结果进行了比较。发现在永冻层土壤中，通过三种方法检测到的都是Proteobacteria, Actinobacteria 和 Chloroflexi 三种微生物门是最丰富的。就微生物种类的丰度来说在三种组学中得到的分布具有一致性。通过对 MT 与 MG 得到的结果的比较，我们可以解释许多参与生化循环的基因。这里用 MT/MG 表征基因的活性，我们可以热熔洼地中 Methanogenesis (产甲烷有关的基因) 的 MT/MG ，据此推测在热熔洼地中甲烷产生率。由宏基因组得到的功能转录组的分布发现，热熔洼地和活动层有很多共同的转录本，而且主要是 transporters。而且相对于三种土壤共同拥有的转录本和蛋白质来说，三种土壤拥有更多的相同基因。由此可以推测，在冰冻土壤融化的三个阶段，微生物的组成实际上变化不是很大，但行使功能或者说具有活性的微生物差别是很大的。

　　意义 (Significance)

　　利用多组学的方法揭示了微生物在完整的永冻层中的活动，为控制全球气候变暖提供了理论支撑。

　　原文: Hultman, J. et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature, 521: 208-212(2015).

宏基因组学分析深海热液羽流中的微生物功能

　　目标 (Goal)

　　探索深海热液羽流中的微生物的作用机制。

　　背景 (Background)

　　深海热液羽流发生在各地海洋的中洋脊和后弧盆，深海热液口被认为是地球深部的窗口, 海水下渗到海底以下两、三千米和高温岩浆相互作用。热液流体中携带有大量还原性的物质 (氢气、硫化物、金属离子) 与周围氧化的冰冷的海水 (2-4℃) 相互混合, 形成几百米到几千米的热液羽流。热液口附近形成巨大的温度和化学梯度, 为微生物的生长提供了充足的能源和营养元素。深海热液羽状流中的微生物过程影响全球海洋的生物地球化学。

　　结果 (Results)

　　研究者通过宏基因组学和生物能量模型来描述深海热液羽状流中微生物的丰度和遗传潜力。研究中通过对测序数据进行Binning 发现了 331 个不同的基因组“箱”，包括古细菌、细菌、真核生物和病毒的大约 951 个基因组。宏全基因组分析可知在微生物群落中硫氧化是超为丰富多样的化能自养的微生物代谢。硫氧化的基因通常存在于包含氢和甲烷氧化的基因的基因组箱中，表明这些微生物组中的代谢多样性。生物能量热力学模型支持宏基因组分析，表明元素硫与氧的氧化是水热羽流中主要的分解代谢反应。

　　意义 (Significance)

　　通过研究深海热液羽流中的微生物功能，阐明了热液羽状流中的微生物作用机制，尤其为今后研究全球海洋的生物地球化学过程提供了大量的基因组数据。

　　原文: Anantharaman, K. et al. Metagenomic resolution of microbial functions in deep-sea hydrothermal plumes across the Eastern Lau Spreading Center. The ISME journal, 10: 225-239(2016).

　　1. 宏基因组测序样品总 DNA 的提取及基因或基因组 DNA 的富集注意事项

　　提取的样品 DNA 必须可以代表特定环境中微生物的种类，除需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总 DNA 是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的 DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。应严格操作，谨防污染，并且保持 DNA 片段的完整和纯度。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集，常用的富集方法有稳定同位素探针、抑制性消减杂交、差异显示、噬菌体展示、亲和捕获及 DNA 微阵列等技术。

　　2. 针对 16S rDNA 测序和宏基因组 de novo 测序有什么不同

　　16S rDNA 测序是针对细菌核糖体小亚基的特定高变区进行 PCR 扩增，反映物种的进化关系及群落多样性。宏基因组 de novo测序测定整个环境中所有微生物的基因组。在数据分析上又可以分为基因集分析和基因组组装。基因集分析可以进行功能分析 GO pathway;基因组组装可以获得新的，甚至是不可纯培养的微生物基因组序列。