宏转录组

宏转录组从整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命全部基因组转录情况及转录调控规律，宏转录组测序以样品中的全部RNA为研究对象，从转录水平上分析微生物群落中活跃菌种的组成及活性基因的表达。宏转录组测序避开未培养微生物的分离培养问题，能有效扩展微生物资源的利用空间。

宏转录组测序流程图

　　分析内容

　　1. 原始数据除杂及质量评估

　　2. 差异表达分析

　　3. GO 分类

　　4. 代谢通路分析

　　5. 差异表达的 Unigene 的 GO 和 KEGG pathway 富集分析

　　6. 根据客户需求可进行个性化分析

　　样品信息

　　1. 样品类型： RNA；

　　2. 样品浓度：≥ 20 ng/μL；

       3. 样品质量：OD 260/280应在 1.8 到 2.2 之间，OD 260/230 ≥ 2.0，23S:16S ≥ 1.0；     

       4. 确保RNA无降解，无污染；

　　5. 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输。

宏转录学分析泡菜发酵过程中乳酸菌的基因表达

　　背景 (Background)

　　泡菜是通过发酵制成的一种韩国传统食物。发酵过程中有多种乳酸产生，与其他环境生态系统如土壤，海水或人类结肠相比，发酵食品如泡菜同样具有复杂的微生物生态系统。

　　结果 (Results)

　　基于16S rRNA 的测序分析表明泡菜发酵过程中微生物生态系统主要是 6 种乳酸菌。在此结果基础上，对泡菜发酵期间五个时间点的样品进行了宏转录组测序分析，然后利用 MG-RAST 分析这些测序数据来揭示发酵期间宏转录组基因表达谱。首先利用MG-RAST将mRNA序列分配到代谢基因发现了碳水化合物代谢和乳酸发酵的普遍性。mRNA测序序列与六个乳酸菌菌株的基因组比对发现，在发酵早期肠膜状明串珠菌肠系膜细胞较为活跃，在后期则为米酒乳杆菌和魏斯氏杆菌较为活跃。许多参与碳水化合物转运、水解和乳酸发酵相关的基因积极地表达，这是典型的异戊酸发酵。在所有明串珠菌属物种中，尤其是肠膜状明串菌都鉴定出甘露醇脱氢酶编码基因(mdh)。甘露醇脱氢酶编码基因的三个拷贝 (染色体上两个拷贝，质粒上一个拷贝) 具有不同的表达模式。这些结果有助于了解在发酵过程中的乳酸菌群体中的活性群体和基因表达。

　　原文: Jung, J. Y. et al. Metatranscriptomic analysis of lactic acid bacterial gene expression during kimchi fermentation. International journal of food microbiology, 163: 171-179(2013).

通过全部 RNA 和 pyrotag 测序研究北海硅藻水华中海洋浮游细菌的多样性和活性

　　背景 (Background)

　　浮游植物总量占地球上光合生物量的比列不到1%，但浮游植物的净初级生产量却占到一半。有一小部分浮游植物会下沉到海底，被原生生物、桡足类、鱼类以及浮游细菌快速消耗。浮游细菌在浮游植物的再循环中起着关键作用，其中分解藻类生物量的细菌群落是多样的，由不同的异养类群组成，具有不同的生态策略。然而关于这些细菌群落的动态和功能相互之间的作用知之甚少。

　　结果 (Results)

　　在春季硅藻水华结束时，对德国的海岸线的浮游细菌群落进行调查，结果揭示了不同细菌类群的群落演替。宏基因组学和宏蛋白质组学研究表明这些进化枝的浮游细菌利用不同的底物光谱并消耗不同藻类底物。上述的方法提供了关于细菌群落组成和基因表达以及评估不同进化枝浮游细菌代谢活动水平新见解。研究者也发现最丰富的类群主要有FlavobacteriaAlphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria。宏转录数据与宏基因组数据比对证实 Formosa 与 Polaribacter 是主要降解藻类的细菌，而 Rhodobacteraceae和 Reinekea spp 表现出较少的底物光谱。此外，研究也发现红细菌和变形菌 SAR92 进化支表现出高代谢活性水平，这表明这些进化支细菌在硅藻水华期间发挥了重要的作用。

　　原文: Anna, K. et al. Diversity and activity of marine bacterioplankton during a diatombloom in the North Sea assessed by total RNA and pyrotag sequencing. Marine Genomics, 18:185–192(2014).

富营养淡水湖蓝藻水华中次生代谢产物基因表达与细菌功能的相互作用

　　背景 (Background)

　　全球范围内有害蓝藻水华的频繁暴发，并且绝大多数水华蓝藻会向水体释放蓝藻毒素，给动物和人类的饮用水安全带来极大的危害。该研究针对一个浅水富营养化蓄积池，该水库长期经历有害蓝藻水华。该研究的目的是鉴定水库中微囊藻和其他主要物种在昼夜更替下的基因表达的动态变化和差异性，洞察能够影响水体质量的毒素合成和部分营养、能量循环相关的功能。

　　结果 (Results)

　　在所有样品中来自微囊藻的转录物占主导地位，并且伴有至少533个属水平上蓝细菌，变形杆菌，拟杆菌和放线菌的转录本。在微囊藻群体内，很多转录本是与浮力、光合作用和毒素合成的相关的，表明这些是水库中竞争优势所必需的。白天，微囊藻转录物富集途径包括光合作用和能量代谢，而在晚上富集途径包括DNA复制和修复，毒素的生物合成。微囊藻转录物的主要来源是聚酮化合物和非核糖体肽合酶(分别为PKS和NRPS)基因簇。在整个昼夜周期内，所有PKS/ NRPS基因簇的表达都会发生，转录物包括毒素微囊藻毒素和绿脓毒素。来自微囊藻的表达的PKS / NRPS基因簇与任何已知的产物都无关。水库中四个丰富的门富集了不同的功能，包括光合作用(蓝细菌)，复杂有机分子(变形菌)的分解，糖基代谢(拟杆菌)和植物碳水化合物如纤维二糖(放线菌)的分解。这些结果提供了在有害藻类水华中有关次级代谢产物基因表达评估，功能分配和功能的相互作用。

　　原文: Kevin, P. et al. Secondary metabolite gene expression and interplay of bacterial functions in a tropical freshwater cyanobacterial bloom. ISME Journal, 8:1866–1878(2014).

1. 宏转录组测序取样有哪些注意事项?

　　要注意避免 RNA 酶的污染，取样的所需耗材和器具等都需要 RNAase-free 处理，样品液氮速冻，干冰寄送，避免反复冻融。